細(xì)胞增殖-毒性檢測試劑盒   Cell Counting Kit-8(CCK-8)

產(chǎn)品貨號：CK001

儲存條件：CCK-8溶液在避光，0-5℃的條件下可以保存一年； -20℃下保存2年；如需經(jīng)常使用請將試劑存放在0-5℃，為防止背景值增加干擾實驗結(jié)果，請勿反復(fù)凍融。

CCK-8試劑使用方法

一、通用操作步驟

1. 在96孔板每孔加入100uL細(xì)胞懸液； 2.在培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)細(xì)胞；3.向培養(yǎng)板中加入藥物(如果不加藥物，直接進行第五步操作)；4.在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一段時間；5. 向每孔加入10 μL的CCK溶液；6. 將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1～4小時(根據(jù)具體實驗優(yōu)化)。7. 用酶標(biāo)儀測定在450nm處的吸光度

二、制作標(biāo)準(zhǔn)曲線（測定細(xì)胞具體數(shù)量時）

1、先用細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)所制備的細(xì)胞懸液中的細(xì)胞數(shù)量，然后接種細(xì)胞。

2、按比例(例如:1/2比例)依次用培養(yǎng)基等比稀釋成一個細(xì)胞濃度梯度，一般要做3-5個細(xì)胞濃度梯度，每組3-6個復(fù)孔。

3、接種后培養(yǎng)2-4小時使細(xì)胞貼壁，然后加CCK試劑培養(yǎng)一定時間后測定OD值，制作出一條以細(xì)胞數(shù)量為橫坐標(biāo)(X軸)，OD值為縱坐標(biāo) (Y軸)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線可以測定出未知樣品的細(xì)胞數(shù)量(用此標(biāo)準(zhǔn)曲線的前提條件是實驗的條件要一致，便于確定細(xì)胞的接種數(shù)量以及加入CCK后的培養(yǎng)時間)

三、細(xì)胞活性檢測

1、在96孔板中接種細(xì)胞懸液（100μL/孔）。將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)（在37 °C,5% CO₂的條件下）。

2、向每孔加入10 μL的CCK溶液（注意不要在孔中生成氣泡，它們會影響OD值的讀數(shù)）。

3、將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1-4小時。

4、用酶標(biāo)儀測定在450nm處的吸光度。

5、如果暫時不測定OD值，打算以后測定的話，可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。在24小時內(nèi)吸光度不會發(fā)生變化。

四、細(xì)胞增值-毒性檢測

使用方法（以96孔板為例，其他規(guī)格培養(yǎng)板按實際情況安排）：

1、在96孔板中配置100μl的細(xì)胞懸液（通常細(xì)胞增殖實驗每孔加入100μl 2000個細(xì)胞，細(xì)胞毒性實驗每孔加入100μl5000個細(xì)胞。具體每孔所用的細(xì)胞的數(shù)目，需根據(jù)細(xì)胞的大小，細(xì)胞增殖速度的快慢等因素決定）。按照實驗需要，進行培養(yǎng)（在37 °C，5%CO2,，的條件下）預(yù)培養(yǎng)24小時。

2、向培養(yǎng)板加入1-10μl不同濃度的待測藥物刺激。

3、將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育一段適當(dāng)?shù)臅r間（后面有具體細(xì)胞的建議時間，例如：6、12、24或48小時）。

4、每孔加入10μlCCK-8溶液（注意不要在孔中生成氣泡，它們會影響OD值的讀數(shù)）。如果起始的培養(yǎng)體積為200μl，則需加入20μl CCK-8溶液，其他情況以此類推。可以用加了相應(yīng)量細(xì)胞培養(yǎng)液和CCK-8溶液但沒有加入細(xì)胞的孔作空白對照。如果擔(dān)心所使用的藥物會干擾檢測，需設(shè)置加了相應(yīng)量細(xì)胞培養(yǎng)液、藥物和CCK-8溶液但沒有加入細(xì)胞的孔作為空白對照。

5、在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育1-4小時，對于大多數(shù)情況孵育1小時就可以了。時間的長短根據(jù)細(xì)胞的類型和細(xì)胞的密度等實驗情況而定，初次實驗時可以在0.5、1、2和4小時候分別用酶標(biāo)儀檢測，然后選取吸光度范圍比較適宜的一個時間點用于后續(xù)實驗。

6、用酶標(biāo)儀測定在450nm處的吸光度，如無450nm濾光片，可以使用420-480nm的濾光片。可以使用大于600nm的波長，例如650nm，作為參考波長進行雙波長測定。

7、如果暫時不測定OD值，打算以后測定的話，可以向每孔中加入10μl 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。在24小時內(nèi)吸光度不會發(fā)生變化。

8、注意：如果待測物質(zhì)有氧化性或還原性的話，可在加CCK之前更換新鮮培養(yǎng)基（除去培養(yǎng)基，并用培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞兩次，然后加入新的培養(yǎng)基），去掉藥物影響。當(dāng)然藥物影響比較小的情況下，可以不更換培養(yǎng)基，直接扣除培養(yǎng)基中加入藥物后的空白吸收即可。

活力計算： 細(xì)胞活力*（％）=[A(加藥)-A（空白）]/[A（0加藥）-A（空白）] ×100
A（加藥）：具有細(xì)胞、CCK溶液和藥物溶液的孔的吸光度
A（空白）：具有培養(yǎng)基和CCK溶液而沒有細(xì)胞的孔的吸光度
A（0加藥）：具有細(xì)胞、CCK溶液而沒有藥物溶液的孔的吸光度
*細(xì)胞活力：細(xì)胞增殖活力或細(xì)胞毒性活力

注意事項：

1、由于使用96孔板進行檢測，如果細(xì)胞培養(yǎng)時間較長，一定要注意蒸發(fā)的問題。一方面，由于96孔板周圍一圈最容易蒸發(fā)，可以采取棄用周圍一圈的辦法，改加PBS，水或培養(yǎng)液；另一方面，可以把96孔板置于靠近培養(yǎng)箱內(nèi)水源的地方，以緩解蒸發(fā)。

2、CCK-8檢測細(xì)胞活性的原理是通過檢測活細(xì)胞脫氫酶催化的反應(yīng)。任何待測體系中存在還原劑，例如一些抗氧化劑會干擾檢測，需設(shè)法去除。如果待測物質(zhì)有氧化性或還原性的話，可在加CCK-8之前更換新鮮培養(yǎng)基，去掉藥物的影響。當(dāng)然藥物影響比較小的情況可以不更換培養(yǎng)基，直接扣除培養(yǎng)基中加入藥物后的空白吸收即可。

3、建議先做幾個孔摸索接種細(xì)胞的數(shù)量和加入CCK-8試劑后的培養(yǎng)時間。

4、建議采用多通道移液器，可以減少平行孔間的差異。加入CCK試劑時，建議斜貼著培養(yǎng)板壁加，不要查到培養(yǎng)基液面下加樣，溶液產(chǎn)生氣泡，會干擾OD值讀數(shù)。

5、當(dāng)使用標(biāo)準(zhǔn)96孔板時，貼壁細(xì)胞的最小接種量至少為1000個/孔（100μl培養(yǎng)基）。檢測白細(xì)胞時的靈敏度相對較低，因此推薦接種量不低于2500個/孔，（100μl培養(yǎng)基），且培養(yǎng)時間長一些。如果要使用24孔板或6孔板實驗，請先計算每孔相應(yīng)的接種量，并按照每孔培養(yǎng)基總體積的10%加入CCK-8溶液。

6、加入CCK-8溶液時，如果細(xì)胞培養(yǎng)時間較長，培養(yǎng)基顏色已變化或PH值變化。建議換用新鮮的培養(yǎng)基。

7、如果沒有450nm的濾光片，可以使用吸光度在430-490nm之間的濾光片，但是450nm濾光片的檢測靈敏度最高。

8、酚紅和血清對本試劑盒的測定無明顯影響。培養(yǎng)基中酚紅的吸光度可以在計算時，通過扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不會對檢測造成影響。

9、為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

CCK-8 試劑參考實驗數(shù)據(jù)

（此數(shù)據(jù)僅供參考，建議預(yù)先摸索最佳實驗條件）